致泻性大肠杆菌引起的急性泻肚是发展中国度执续存在的全球卫生禁锢，严重危及儿童健康。传统上依赖培养的大肠杆菌血清分型依次耗时极力，加上高质料抗血清需要入口取得，导致惯例微生物执行室一半以上的致泻性大肠杆菌分离株无法告捷进行血清分型淫香淫色，大大影响了对食源性疾病暴发的快速叮属，成为包括我国在内的雄伟发展中国度细菌学签订界限的一个卡脖子问题。同期，致泻性大肠杆菌血清型与致病型之间的关联，亦然微生物界限一直以来悬而未决的穷苦。
2024年9月21日，学院李庆阁诠释团队与深圳市疾病贪污收尾中心扈庆华诠释团队调解发表于海外期刊Gut Microbes（IF=12.2）的一项琢磨中，报谈了一种同期识别大肠杆菌182种O抗原、53种H抗原靶基因和12种毒力基因的分子分型平台，大概在4小时内签订粪便样本中致泻性大肠杆菌的血清型，琢磨进一步通过五个省份的多中心临床历练揭示了致泻性大肠杆菌血清型与致病型之间的径直关联，并有时发现大肠杆菌血清型特征基因不错手脚分辨志贺氏菌和肠谈侵袭性大肠杆菌（EIEC）的生物标志物。
该琢磨基于厦门大学团队于2022年发表在PNAS的高阶多重PCR时期“MeltArray”和“荧光-熔点”二维标签战略，所建树的MeltArray EST分子分型平台仅需5个多重PCR反馈，即可识别五类致泻性大肠杆菌的12个毒力基因、182种O血清型及53种H血清型，障翳险些通盘已知大肠杆菌血清型。值得一提的是，MeltArray EST单个PCR反馈最多可检测62个靶基因，创下了闭管PCR一步法检测靶基因数目的新记录。在176株大肠杆菌参考菌株的考证中，MeltArray EST与传统血清学依次的一致率达96%，与全基因组测序依次的一致率达100%，诠释了其在培养菌株签订中的高准确性。
图1 大肠杆菌分子分型体系建树
大肠杆菌血清型被合计是识别食源性疾病暴发的标志物，关联词基于培养的依次取得分离株的O:H血清型需要近一周的时代，不成快速提供暴发疫情造访的病原学凭证。若是能找到一种不依赖培养的依次，将极大镌汰检测周期，实时叮属暴发疫情的造访。琢磨团队在“荧光-熔点”二维标签战略的基础上创造性提倡“荧光-熔点-峰高”三维标签战略 (图2a)，并通过在阴性粪便中梯度掺入肠谈出血性大肠杆菌EHEC的两组模拟执行，诠释三维标签战略不错径直诳骗于粪便核酸样本的检测，笃定致泻性大肠杆菌毒力基因、O血清型特征基因与H血清型特征基因之间的关联 (图2b)。
图2 “荧光-熔点-峰高”三维标签战略
琢磨团队通过对深圳市一都食品中毒事件的病例肛拭子样本的回归性琢磨，发现通盘的7份病例样本均能检出肠谈致病性大肠杆菌EPEC的特征毒力基因，且融解峰峰高Rm值与血清型特征基因Gp10及H11呈现强议论干系，阐明暴发菌株致病型为EPEC，血清型为Gp10:H11（图3），数字PCR齐全定量及分离株测序证实了上述论断。从而诠释MeltArray EST大概在取得肛拭子样本4小时内对粪便样本中致泻性大肠杆菌告捷进行血清型签订。
图3 不依赖培养食源性疾病暴发的回归性琢磨
情侣 偷拍为全面评估MeltArray EST大限度诳骗成果，琢磨团队在广东、河南、四川、江苏和浙江开展了一项多中心琢磨。历练共相聚了637份来自泻肚患者的大肠杆菌菌株，在544株致泻性大肠杆菌中，签订出218种不同的O:H血清型，每种占总和的不到5%，线路出丰富的血清型种种性（图4）。为了分析血清型与致病型之间的干系，琢磨东谈主员引入了“血清型纯度SP值”的想法，即每个血清型中属于主导致病型的菌株百分比。琢磨收场清晰，O血清型、H血清型和O:H血清型的SP值分别为84.5%、70.5%和97.2%（图5），标明血清型与其对应的致病型型之间存在逐一双应干系。为进一步阐明MeltArray EST的分析收场，琢磨团队从EnteroBase数据库下载全球范围内的全基因组序列进行致病型与血清型揣度，分析收场与MeltArray EST一致，诠释了本琢磨发现的血清型与致病型之间关联的普适性。此外值得喜欢的是，琢磨团队在来自广东省和河南省的菌株中监测到4株EAEC O104:H4，该血清型是2011年导致欧洲一都导致严重疾病溶血性尿毒轮廓征（HUS）疾病暴发的元凶，形成4000多东谈主感染，其中50东谈主物化。尽管这4株菌株比较于欧洲菌株枯竭编码志贺毒素的stx2基因，关联词已有报谈EAEC O104:H4可通过基因水平转动取得stx2基因，领导在天下加强该血清型监测的必要性。
图4 中国五个省份致泻性大肠杆菌致病型与血清型地舆散布
图5 致泻性大肠杆菌致病型与血清型的关联
原理的是，MeltArray EST还初次竣事了肠谈侵袭性大肠杆菌（EIEC）和志贺氏菌（Shigella）的明确分辨。琢磨团队对257株志贺菌和18株肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）进行了血清型分子签订，并从EnteroBase数据库下载了775个志贺氏菌分离株和360个EIEC分离株的全基因组序列（前者障翳了4种志贺氏菌的52种血清型，后者代表了45种大肠杆菌血清型）进行基于特征序列的血清型揣度。收场清晰，前者的血清型纯度SP值达到100% (275/275)，后者高达99.8% (1133/1135)（图6），证实志贺氏菌和EIEC由完全不同的O:H血清型组成。尽管绝大部分志贺氏菌和EIEC的H抗原（鞭毛卵白）不抒发，但在本琢磨中险些通盘志贺氏菌和EIEC菌株（98.4%，1387/1410）中都签订出了编码H抗原的基因，这解释了为什么不错通过MeltArray EST分辨志贺氏菌和EIEC，但不成通过传统的基于抗血清的凝集反馈完全分辨这两种细菌。
图6 基于O:H血清型分辨志贺氏菌与EIEC
MeltArray EST手脚一种高效的血清型分子分型器具，填补了致泻性大肠杆菌血清型签订的空缺，揭示了恒久以来无法回应的血清型与致病型之间的关联，其普通诳骗无疑将进一步普及致泻性大肠杆菌的签订的准确性、服从和时效性。
厦门大学人命科学学院博士杜琛（现责任于深圳疾控）、全球卫生学院副诠释廖逸群为共同第一作家，厦门大学人命科学学院李庆阁诠释、许晔副诠释和深圳疾控扈庆华诠释为共同通信作家。共同作家包括厦门大学博士琢磨生周淑娟、杨兆辉，硕士琢磨生丁聪聪、黄佳钰、徐夷妍，深圳疾控石晓路长处、李迎慧主任技师、江敏主任技师、左乐、李民旭，华大基因边圣哲，国度感染性疾病临床医学琢磨中心李力强博士，以及盐田区疾控肖娜科长。该琢磨还得到了中国科学院杭州医学琢磨所谭蔚泓院士、好意思国新泽西州立大学Karl Drlica诠释、厦门大学赵西林诠释以及赖心河诠释的劝诱与匡助。该琢磨得到了国度科技流弊专项、国度重心研发筹商、内蒙古自治区流弊科技样式、福建省高校产学研辘集革命样式、厦门市流弊科技样式、深圳市可执续发展专项和深圳市“三名工程”的资助。
李庆阁诠释团队恒久从事荧光PCR尤其是多重荧光时期平台琢磨，2001年文告一种新的寡核苷酸杂交反馈格式（Nucleic Acids Research），发明置换探针和置换引物（中、好意思、日、澳及欧洲专利授权）；2004年提倡置换探针基因分型时期（Nucleic Acids Research）；2006年发明探针编码实时PCR（Clinical Chemistry，中国发明专利授权）；2011提倡自淬灭探针的多色探针融解弧线变异分析时期（Journal of Molecular Diagnostics，中、好意思专利授权），2013年提倡基于统一反馈的“荧光—熔点”二维符号时期（Nucleic Acids Research，中、好意思、欧洲专利授权）。2022年发明融解阵列时期（PNAS，中、好意思、日、韩、欧洲专利授权）。
原文一语气：https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2401944
（图/文 李庆阁诠释团队）淫香淫色